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JYY-0570

背景描述

原癌基因 KRAS 编码的 K-Ras 蛋白是 RAS/MAPK 信号通路的重要组成部分，负责细胞生长、增殖、成熟和分化等过程的调控。KRAS 基因的突变是最常见的癌症发生的原因，约 30%的癌症患者都存在 KRAS 突变，其中 90%的胰腺癌和 50%的结肠癌存在 KRAS 突变 。这些突变主要表现为单碱基错义突变，其中超过 80%的突变发生在第 12 个氨基酸残基（G12）。KRAS G12D 突变是胰腺癌和结直肠癌最常见的 KRAS 突变，也广泛存在于肺癌和直肠癌中 [1-2]。G12D 突变增强 K-Ras 蛋白的激活，导致细胞不受控制的生长和分裂，促进肿瘤的发生。K-Ras 蛋白在小鼠和人之间高度保守，仅存在两个 132 和 187 两个氨基残基位点的不同。

抑癌基因 TP53 编码细胞肿瘤抗原 P53 蛋白，该蛋白能调节细胞周期，促使细胞凋亡或衰老，从而避免癌变。P53蛋白是一种肿瘤抑制蛋白和转录因子，可调控细胞分裂，阻止 DNA 突变或受损的细胞进行分裂并通过转录调控向这些细胞传导凋亡信号，阻止肿瘤形成。TP53 突变与肿瘤的转移有密切的关系，是癌症晚期的关键因子。TP53在癌症中最常见的突变为 R175H，该突变抑制了 P53 蛋白的功能，能驱动中性粒细胞在胰腺肿瘤中的积累，从而促进胰腺癌对免疫疗法的抵抗。小鼠 Trp53 是人类 TP53 的同源基因，小鼠 Trp53 R172H 突变和人 TP53 R175H 突变高度同源，同样具有促进肿瘤发展和转移的功能 。

KPC 小鼠同时携带 K-Ras G12D 和 LSL-Trp53 R172H 两种致病突变。首先将 LSL-K-Ras G12D 小鼠（条件性过表达K-Ras G12D 突变基因小鼠）与 LSL-Trp53 R172H 小鼠（条件性过表达 Trp53 R172H 突变基因小鼠）杂交，产生基因组中携带但不表达两种致病突变基因的小鼠，即 KP 小鼠。然后将 KP 小鼠与 Pdx-Cre 小鼠（胰腺特异性 Cre重组酶表达小鼠）杂交以产生 KPC 小鼠，该小鼠在 Pdx 启动子的调控下，通过 Cre 重组酶特异性删除胰腺组织中的 Loxp-Stop-Loxp（LSL）基因沉默元件，使 K-Ras G12D 和 Trp53 R172H 突变基因选择性的在胰腺组织中表达。K-Ras G12D 突变和 Trp53 R172H 突变使胰腺肿瘤发展更为迅速，同时转移潜力加大 。KPC 新生小鼠胰腺正常，不存在肿瘤细胞，在 8 至 10 周龄时，胰腺内开始出现前体病变或胰腺上皮内瘤变（PanIN）；大多数小鼠在 16周龄时发展出局部侵入性胰腺导管腺癌（PDAC），并伴有密集的促纤维增生反应。肿瘤通常具有中等分化的导管形态，具有广泛的间质结缔组织增生，类似于在人类肿瘤中观察到的最常见形态。此外，在约 80%的 KPC 小鼠中体内可以观察到肿瘤的转移，主要在肝脏和肺部组织中，这些部位也是人类胰腺癌常见的转移部位 。考虑到个体差异性和环境因素的影响，该模型的发病成瘤情况以实际为准。

突变情况如下：

KPC 0409 :KrasG12D/G: Trp53R270H

KPC 0416 :KrasG12D/D: Trp53R270H

培养条件

准备 DMEM +胎牛血清 10%+P/S 1%

气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

细胞特征

1）来源：小鼠 胰腺

2）形态：贴壁生长

冻存条件

无血清冻存液。

细胞检测

不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

供应限制

仅供科研使用

运输方式

常温或冻存（T25瓶或者1mL冻存管包装）

注意事项

细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

1） 冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.吸去培养液，加PBS清洗1-2遍，去PBS。加入0.25%胰酶2ml消化15秒，去胰酶。将培养瓶放37度培养箱，靠残余胰酶继续消化细胞3-10分钟直至细胞变圆（每3分钟观察一次。）

2.加12ml完全培养基，吹打均匀，即可分到2个T25培养瓶里。（细胞1传2，若顾客使用培养皿或培养孔板，建议先包被）

3） 细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。