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JYY-0408

背景描述

THLE-2 是从供体左叶分离的上皮细胞，TTHLE-2 ( ATCC CRL-2706和 THLE-3 ( ATCC CRL-11233 ) 细胞系是通过感染 SV40 大 T 抗原从原代正常肝细胞中获得的。[RF84749] 该病毒是通过引入含有将SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片段导入两性包装细胞系PA317。[RF84750] THLE-2 和 THLE-3 细胞表达正常成人肝上皮细胞的表型特征。当注射到无胸腺裸鼠体内时，它们不会产生肿瘤，具有接近二倍体的核型，并且不表达甲胎蛋白。[RF84750] THLE-2 和 THLE-3 细胞将苯并[a]芘、N-亚硝基二甲胺和黄曲霉毒素 B1 代谢为其*终致癌代谢物，这些代谢物会加合 DNA，这表明功能性细胞色素 P450 途径。[RF84750] 其他参与化学致癌物代谢的酶，例如环氧化物水解酶、NADPH 细胞色素 P450 还原酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽 S-转移酶和谷胱甘肽过氧化物酶也被 THLE 细胞保留。

培养条件

准备BEGM kit培养基 备注：培养基包含（A+B），ATCC 不使用 BEGM 试剂盒提供的 GA（庆大霉素-两性霉素 B 混合物） 和肾上腺素（Epinephrine），另向其中添加额外的 5 ng/mL  EGF、70 ng/mL 磷酸乙醇胺和 10% FBS。可根据实验要求添加P/S双抗，1%。

A： BEBM 基础培养基  500ML

B:  细胞生长添加剂        一套（包含下列试剂）

● BPE, 2.0 ml ● Hydrocortisone, 0.5 ml    ● hEGF, 0.5 ml

● Epinephrine, 0.5ml  ● Insulin,0.5 ml      ● Transferrin, 0.5 ml

● Triiodothyronine, 0.5 ml ● Retinoic Acid, 0.5 ml ● GA, 0.5ml

注意：所使用的烧瓶应预涂上0.01 mg/mL纤维连接蛋白、0.03 mg/mL牛I型胶原蛋白和0.01 mg/mL牛血清白蛋白的混合物，这些混合物溶于BEBM培养基中。

该细胞生长缓慢，培养周期2-3周左右。

气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

细胞特征

1）来源：：肝; 左叶

2）形态：上皮细胞样，贴壁生长

冻存条件

无血清冻存液。

细胞检测

不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

供应限制

仅供科研使用

运输方式

常温或冻存（T25瓶或者1mL冻存管包装）

注意事项

细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

1） 冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.吸去培养液，加PBS清洗1-2遍，去PBS。加入0.25%胰酶2ml消化15秒，去胰酶。将培养瓶放37度培养箱，靠残余胰酶继续消化细胞3-10分钟直至细胞变圆（每3分钟观察一次。）

2.加12ml完全培养基，吹打均匀，即可分到2个T25培养瓶里。（细胞1传2，若顾客使用培养皿或培养孔板，建议先包被）

3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。