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JYY-0559

背景描述

Ect1/E6E7 是一个上皮细胞系，于1996年从一名43岁白人女性患者因子宫内膜异位症接受子宫切除术时从外宫颈分离出来。和内颈管End1/E6E7 (ATCC CRL-2615)细胞系同一个组织供体建立。在多聚联合的存在下，通过逆转录病毒载体LXSN-16E6E7对传代3次的细胞进行永生化。克隆在含有G418的培养基中筛选。在没有刺激的情况下，细胞会产生巨噬细胞集落刺激因子 (M-CSF)、转化生长因子β1、白细胞介素8 (IL-8)、前列腺素E2、分泌型粒细胞-巨噬细胞抑制因子和多聚免疫球蛋白受体。用干扰素γ和肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激可诱导或显著上调这些细胞系中多种细胞因子和趋化因子以及主要组织相容性复合体（MHC）II类抗原的表达。细胞系可以为有效的、可重复的体外模型提供基础，用于研究宫颈阴道生理学和感染以及测试用于阴道内应用的药物。

培养条件

准备角质细胞无血清培养基 (包含两个组份：基础培养基1瓶500mL+生长因子1管5mL)，添加氯化钙44.1 mg/L（最终浓度0.4 mM）同时添加1% P/S 来培养细胞。或者 准备Defined K-SFM (part of kit NO:,10744-019) 添加氯化钙44.1 mg/L（最终浓度0.4 mM）来培养细胞。

注意：

1 该细胞生长依赖于人表皮生长因子EGF，故而生长不能过密，请在融合度达到80%时进行传代。在无血清培养体系中，细胞生长缓慢并且需要一些时间才能贴壁，可以根据实验要求酌情添加1%FBS来进行培养。

2 使用0.05%胰酶消化细胞，由于角质细胞无血清培养基或者Defined K-SFM为无血清培养液无法终止胰酶消化，所以消化完成后要通过离心（建议125xg离心5-10分钟）（或者加入3-4mL用RPMI 1640或者DMEM等基础培养基配置的含10%FBS）的培养基来终止消化，1000rpm/5min,去除胰酶后再加入细胞完全培养液进行传代培养。气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

细胞特征

1）来源：43岁白人女性患者外宫颈

2）形态：上皮细胞样 贴壁生长

冻存条件

无血清冻存液。

细胞检测

不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

供应限制

仅供科研使用

运输方式

常温或冻存（T25瓶或者1mL冻存管包装）

注意事项

细胞接收后的处理：

1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据。

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的完全培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

1） 冻存细胞的复苏：

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。

2） 细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.吸去培养液，加PBS清洗1-2遍，去PBS。加入0.25%胰酶2ml消化15秒，去胰酶。将培养瓶放37度培养箱，靠残余胰酶继续消化细胞3-10分钟直至细胞变圆（每3分钟观察一次。）

2.加12ml完全培养基，吹打均匀，即可分到2个T25培养瓶里。（细胞1传2，若顾客使用培养皿或培养孔板，建议先包被）

3） 细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每1ml冻存液含1×10⁶~1×10⁷个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。

备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。  收到细胞后第一次传代建议T25培养瓶1：2传代 。